Pabst, U., Demuth, Jutta , Gebel, T. and Dunkelberg, H. (1997) Etablierung einer Methode zum Nachweis der Assoziation von Legionella sp. mit A / A PCR-method for the detection of the association between Legionella sp. and Amoeba sp. . Zentralblatt für Hygiene und Umweltmedizin, 199 (6). pp. 568-577.

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Abstract

Abstract
With two pairs of primers for the amplification of the MIP- (macrophage infectivity potentiator) and the SS rDNA-fragment, it was possible to establish a DNA extraction and a PCR method for the detection of Legionella sp. in water-samples and, after cultivation, in Amoeba sp.. Therefore, water-samples from a warmwater-system in a hospital were taken. In all samples, legionellae were detected by the PCR method and identified by cultivation and a direct immunfluorescence-method as L. pneumophila (serogroup 1). Legionellae and amoebae of the same water sample were cocultured. Legionellae were also adherent at the outer-membrane. To separate the amoebae from the legionellae, the amoebae were sedimented selectively by centrifugation at 200 x g. This washing procedure had to be repeated seven times in order to eliminate the extraamoebale legionellae for sure.

After DNA-extraction of water samples and heat treatment of the intraamoebale legionellae respectively, the amplification was performed with the MIP- and 5S rDNA-primers.

In 14 of 16 cocultivations growth of legionellae was found. This result and the detection of legionellae and amoebae in the same water samples suggest that an infection of amoebae may also take place in the watersystem of the hospital. This is important for the disinfection as a procedure to eliminate legionellae, since intraamoebale bacteria are more resistant to environmental manipulation.

Because in two of the cocultivations no growth of legionellae in amoebae was found, it can be assumed that only specific subtypes of legionellae can infect amoebae species.

Zusammenfassung
Zum Nachweis von Legionelia sp. aus Wasserproben sowie von intrazellulären Legionellen nach Kokultur mit Amoeba sp. konnte ein DNA-Extraktionsverfahren und eine Po- lymerasekeftenreaktion (PCR)-Methode mit Hilfe der Primerpaare für ein Fragment des 5S rDNA-Gcns und ein Fragment des iVllP (macrophage infectivity potentiator)-Gens entwickelt werden. Als Untersuchungsmaterial dienten Proben aus dem Warmwasserleitungssystem eines Krankenhauses. Zunächst wurden mit Hilfe eines DNA-Extraktionsverfahrcns und der PCR-Methode in allen Wasserproben Legionellen nachgewiesen und mittels direkter Immunfluoreszenz als Serogruppe 1 identifiziert. Anschließend wurden Legionellen und Amöben, die aus derselben Wasserprobe isoliert wurden, kokultiviert. Amöben ließen sich nach dieser Kokultivierung durch Zentrifugation bei 200 X g selektiv sedimentieren und dadurch von extrazellulären Legionellen befreien. Dieser Waschvorgang mußte mindestens siebenmal durchgeführt werden, um sicher alle freien, bzw. außen an den Amöben haftenden Legionellen zu entfernen. Nach Extraktion der DNA bzw. LIitzebehandlung der intraamöbalen Bakterien erfolgte der Nachweis durch Amplifizierung legionellenspezifischer 5S rDNA- und MIP-Fragmente. Von 16 angelegten Kokulturcn konnte in 14 ein intraamöbales Wachstum der Legionellen gezeigt werden. Dieses Resultat in Kombination mit dem simultanen Vorkommen von Legionellen und Amöben in den Wasserproben deutet darauf hin, daß eine Infektion von Amöben mit Legionellen auch im Warmwassersystem des beprobten Krankenhauses stattfindet. Dies wäre für die Durchführung von Sanierungsmaßnahmen von Bedeutung, da in- traamöbale Legionellen gegen Desinfektionsverfahren relativ wirksam geschützt sind. Die Beobachtung, daß nicht bei allen Kokulturen ein intraamöbales Vorkommen der Legionellen gezeigt werden konnte, weist darauf hin, daß nur einige Legionellen-Serogruppen bzw. -Subtypen und/oder Amöbenspezies eine Assoziation eingehen bzw. Unterschiede in der Infektion von Amöben zwischen virulenten und avirulenten Legionellen bestehen.

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